然而，尽管这些居民事先花去几年时间接受了相关培训，拥有每年耗资百万美元的技术支持，各种各样的问题仍然接踵而至。比如技术问题、人与社会问题、生物问题、管理问题等，这些问题最终也导致了此次任务的失败。
1、技术问题
志愿者进入生物圈二号不久，圈内含氧量开始下降，并最终低于14.5%，而正常水平为21%。含氧量低会导致疲劳，并威胁到圈内居民的健康，这相当于高原反应。而一氧化二氮和二氧化碳的含量却在增加。所以这个设备很快就难以运作。为了解决这些问题，科学家们决定向设备注入氧气，并且每天打开“肺部”以允许来自外部环境的空气流入。缺氧的主要原因似乎是因为氧气被生物圈二号的一些混凝土结构吸收了，随后科学家们又通过密封混凝土来克服这个问题。然而，氧气降低或者二氧化碳增加还有一个可能的原因是生物圈内土壤中的微生物过多，它们会将氧气转化为二氧化碳。
除此之外，还存在空气泄露。有人指出，这种泄露是不可避免的。但是这引起一些人的质疑，密闭的环境是整个项目实施的基础。如果存在空气泄露或者利用外界的地球环境来交换空气，那这个实验还有效吗？还有意义吗？
2、人与社会问题
进入生物圈二号不久，8位居民很快发现他们无法生产足够的食物来养活自己。他们带来了各种用来种植的种子，比如花生、玉米、蔬菜等。然而他们却遇到了各种各样的问题，比如虫害、植物病害，毕竟他们不是专业的种植人员。随着食物危机的加深，他们不得不吃掉一些带来的种子。鸡、猪等家禽也因为面临与居民竞争食物而被吃掉。如此一来，便形成恶性循环，自给自足的幻想破灭。在最初的6个月，他们一直处于饥饿状态，平均体重下降16％。
人际关系问题也是不可避免的。根据参与者之一简·波因特后来发表的文章称，8个人在居住6个月后便分成两派。虽然两个小组一起工作，但是却无法相处。这也导致他们难以齐心协力来解决所面临的问题。
3、生物问题
生物圈二号内的生态系统是由生物圈一号(地球生物圈)过分简化而来的。虽然设计者们把地球上各种类型的生态系统“搬进”了“生物圈”，然而所搬进的主要是生态系统的第一性生产者植被，并未把相应的动物、真菌、微生物等群落也按比例搬来。如热带雨林中没有大型动物，倒是引进土壤时带来了蚂蚁及蟑螂的卵，这些生物在此大量繁殖。还有，几个主要类型的生态系统尤其是热带雨林植物在很高的二氧化碳浓度下生长的非常繁茂, 表现出异常高的光合能力。由于缺乏相应的消费者和分解者而迅速积累，大量的枯落物面临清理问题。过度生长的热带雨林乔木触及了顶部玻璃，大有穿破玻璃之虞。引进藤本植物(如牵牛等)的目的是为了用做固定二氧化碳的汇，却不料这些植物在高二氧化碳浓度环境下疯长，危及其它植物与农田。所有花粉传播动物消失，使一些有赖于此的有花植物不能正常授粉。同时引入的25种脊椎动物中有19种消失。
4、管理问题
也许生物圈二号最严重的问题之一是缺乏高水平的科学管理。在这次任务即将结束时，一个专家团队专门做了一个分析报告。该报告指出该项目的几点不足之处，比如缺乏一个完善的书面的科学计划、缺少科学信息交流和互动等。该报告建议任命一名科学研究主任监督项目的进展，并确保管理人员公开讨论他们的任务进展情况。