与此同时，美国西海岸的加利福尼亚已发现金矿，大批美国人从东部被吸引到西部，掀起了开采黄金的热潮。由于美国西部落基山的险恶地理条件和纵横的河流的阻挡，从东部前往西海岸的人们往往经由海路转道巴拿马地峡，再经海峡路到达假想的黄金国——加利福尼亚，因此，美国开凿巴拿马运河，沟通两大洋的航路的要求更加迫切了。1902年，美国以4000万美元购买了法国公司的全部财产。同时，美国利用英国在南非发动战争失利的时机，在1901年与英国签定条约，迫使英国同意废除原在1850年美英双方承诺的关于不得在运河区拥有所有权和建筑要塞的有关条约，由美国政府单独开凿和控制这个运河。
美国排除了英、法势力后，在1902年便向哥伦比亚政府提出开凿运河和永久租借运河两岸各3英里（约5公里）土地的要求，由于哥伦比亚国内人民的反对，议会拒绝了美国的要求，这大大触怒了美国政府。1903年，美国直接参与和策动了一场所谓“革命”，使巴拿马在1903年11月3日脱离哥伦比亚宣布独立。接着，美国就强迫巴拿马签订了条约，这就是巴拿马人民几十年来进行英勇斗争为之废除的不平等的巴拿马运河条约。条约规定，美国有永久占领、使用、控制巴拿马运河区的权利；美国像主权所有者那样在运河区拥有一切权利、权力和权威，而美国为此仅仅给巴拿马1000万美元，9年后每年再付款25万美元。
1904年美国继续开始巴拿马运河的开凿工程，他们接受法国公司失败的教训，决定修建水闸式运河。那时巴拿马全国只有30万人口，巴拿马城只有2万多人，不可能提供大量劳动力，结果除从当地及西印度群岛雇用工人外，还从非洲购买黑人，从南欧和东南亚、中国雇来数万劳工。据统计，从1880年开工到1914年8月15日完工，共挖土方2亿1千万立方米，整个工程期间死去70000多人，每米差不多就夺去了一条生命，如加上筑铁路中死去的两万多人，在这两项工程中共死去了10多万劳工，因此，人们称这条运河两岸为“死亡的河岸”。
巴拿马运河从1904年开工，到1914年8月15日完工，历时10年，耗资38700万美元。完工这一天，万吨蒸汽货轮“埃朗贡”号首次通过运河。不过，直到1920年7月美国才宣布运河供国际使用。
巴拿马运河沿线山地起伏，沟谷纵横，丛林密布，气候湿热。当时疫病猖獗，开凿运河工程艰巨，劳动条件十分恶劣。比如，现在巴拿马运河中的一段——盖拉特航道，就是在海拔201.8米的戈尔德山和海拔125米的康特拉克特斯山之间的盖拉特沟，硬是开出一段宽91.4米、长近14.5公里的河床。巴拿马运河确是历史的见证，它记载了巴拿马人民和来自非洲、中国、东南亚以及其他一些国家的人民的苦难和辛酸，记载了帝国主义的掠夺和侵略。
巴拿马运河对美国来说，无论从经济利益，还是从军事价值来说都是十分重要的。因此，巴拿马运河被称之为美国的地峡生命线。
运河修成以后，美国就把运河区变成了它自己的领地。运河区由美国总统任命的总督统治，升的旗帜是美国国旗，施行的法律是美国法律，讲的话是英语。根据1903年条约规定，巴拿马从1912年起每年只得25万美元收入，1936年后由于美国取消金本位改为每年给巴拿马43万美元，1955年经过巴拿马人民的斗争，迫使美国修改了条约，取消了美国干涉巴拿马内政的权力，并规定，增加巴拿马从运河获得的收入，每年美国向巴拿马的交付额从43万美元提高到190万美元，后来由于美元贬值又提高到230万美元。
在经济方面，美国国内东、南海岸与西海岸间的经济交往，美国大西洋沿岸与南美大陆西海岸，以及整个太平洋地区的贸易往来，由于运河的通航而更为便捷了。而且，美国从征收世界各国船只通过运河的税收中又攫取了巨额利润。据美国“巴拿马运河公司”发表的统计，在运河供国际使用的60年中，美国攫取了450亿美元的经济收入，平均每年达7.5亿美元左右。此外，因运河开通而缩短航程每年还为美国节约运费开支9亿多美元。据统计，经运河从大西洋到太平洋的贸易中几乎有2/3的货物来自美国；从太平洋到大西洋的贸易中，有39％的货物是运往美国或东海岸和海湾地区的。据数字表明，仅1975年就有14000多艘轮船通过运河，其中70％来往于美国东西海岸港口。美国的煤、焦炭和石油产品许多是经此运河运转的。