比较解剖学和胚胎学所提供的论证生物进化的资料尽管都有说服力，但较为间接。直接论证的资料则来自古生物学，即来自从地层所发掘出来的大量化石材料。地层可以说是名符其实的生物演化史的档案馆。人们可根据从地层中发掘出来的生物的化石遗骸（如骨骼、牙齿、介壳等甚至整体，例如自西北利亚冻土带发掘的猛犸象）、遗迹（足迹和生物体的印痕）和遗物（粪、卵等），将地球上出现生命以来生物发展演化的基本历程有个较正确的了解，当然，限于化石材料的发现不可能非常整齐完善，故而自古生物学材料提供的进化证据也有一定的欠缺，相信此欠缺将随化石资料的不断累积而逐渐得到补充。
按地层形成的先后顺序与生物出现的早晚，将地质年代分为5个代：太古代、元古代、古生代中生代和新生代。每代可分为若干个纪，纪下又可分为世（表22-2）。就动物演化的事实看，最初出现的是无脊椎动物，生活在水中，以后依次出现水生的无颌类至有颌鱼类，然后是开始登陆的两栖类，登陆成功的爬行类，又由爬行类演化出鸟类与哺乳类，最后才出现人类。不同生物类群在演化过程中的相互交替的原因，是由于自然条件的改变而引起某些类群的灭绝和另一些类群的出现，发展和繁盛。
从同一类动物在不同的地层中的变化来看该动物的演化过程的典型例证是马、象和骆驼的化石证据，其中尤以马的化石最为完善和具说服力。关于马的进化可追溯到约5400万年前的始新世的北美所提供的资料，起初以为是一种直线演化，然而实际上是由许多谱系演化来的，即马的系统演化是有许多分支，而大多分支现已绝灭。从地史看，马的演化历程亦存在着广泛的适应辐射，其总的趋势为体形逐渐变大，四肢由短变长，趾（指）数由多变少，牙齿由低齿冠变为高齿冠（图22-8）。最早的马出现于距今约5400万年的第三纪始新世。称之为始新马（Eohippus）或始马（Hyracotherium），外形似狐，大小如狗，前肢4趾，后肢3趾，适于在当时炎热的北美的松软的林地活动，齿冠低而齿根长，适于吃灌木的嫩叶。到距今约4000万年的渐新世，中北美洲逐渐出现广阔的草原，此时期的渐新马（Mesohippus）体形比始祖马略大，前后肢均为3趾，中趾最发达，前肢第5趾遗迹尚存，齿冠仍为低冠，但较始祖马略高，因其食物逐渐由食树叶变成食草。在距今约2600万年的中新世由渐新马适应辐射出几支，其中一支为中新马（Merychipp-us），中新马被认为是现代马的直接祖先。此时期地球的气候变得冷且干燥，大草原遍布全球，此时的中新马完全成为草原动物。食草与快速奔跑，致使体形更高，前后肢虽仍为3趾，但中趾特别发达，2、4趾较退化，臼齿齿冠成为高齿冠，其咀嚼面也形成复杂的皱褶，适于草料的研磨。在我国有内蒙与江苏发现的中新马，称安琪马（Anchitherium）。在距今约700万年的上新世，出现了作为中新马后裔的上新马（Pliohippus），它一直留存至更新世。距今约200万年左右时期，上新马的体型已接近现代马，前后肢仅剩发达的中趾，第2与4趾仅留遗迹（称为赘骨），变成单趾马，臼齿为高冠型。到上新世后期发展成马属的现代马（Equus）。我国华北地区的上新世地层中有多种多样的三趾马（Hipparium）。斑马和驴也是由此演化而来。于更新世冰期时，马属由北美向南美，向欧亚大陆和非洲扩展。本世纪初，野马在新疆与蒙古边界地区尚有存在，但至今在该地是否仍有存在不详。
在古生物化石方面能够清晰显示动物种进化历程的除马外还有象，象的化石也十分齐全。从第三纪由始新世晚期到渐新世早期的始祖象开始，历经古乳齿象、乳齿象、剑齿象、猛玛象直到现存之非洲象与印度象。其演化过程为：体型由小变大，始祖象大小似猪，上颌第二门齿由正常大小到突出成长的象牙，臼齿冠也由低到高，臼齿冠也从小的乳状突演变为一条条粗的横嵴；鼻子也由正常大小逐渐加长为长的象鼻。
